什么是聚合酶链反应?

PCR是实验室中使用的技术,以制造数百万份DNA的DNA副本。它是在20世纪80年代开发的。

PCR是什么?

  • 聚合酶链反应(PCR)最初是由美国生物化学家Kary Mullis于1983年发明的。由于他的开创性工作,他于1993年被授予诺贝尔化学奖。
  • PCR在分子生物学中被用于对小片段进行复制(放大)脱氧核糖核酸或者一个基因
  • 使用聚合酶链反应(PCR)可以从非常少量的DNA中生成一个特定DNA片段的成千上万个拷贝。
  • PCR是医疗和生物研究实验室中使用的常用工具。它用于处理DNA的早期阶段测序,用于检测基因的存在或缺失,以帮助识别病原体在感染期间,当从DNA的微小样品产生法医DNA谱时。

PCR是如何工作的?

  • 每个PCR背后的原理,无论DNA样本是什么,都是一样的。
  • 需要五个核心的“成分”来设置PCR。我们将准确地解释这些在我们走的时候。这些都是:
    • 要复制的DNA模板
    • 引物,启动PCR反应的短段DNA,被设计成与你想复制的DNA片段的任意一边结合
    • DNA核苷酸碱基(也称为dNTPs)。DNA碱基(A、C、G和T)是DNA的基本组成部分,是构建新的DNA链所必需的
    • 聚合酶添加新的DNA基础
    • 缓冲液确保反应的正确条件。
  • PCR涉及一个加热和冷却的过程,称为热循环,由机器进行。
  • 有三个主要阶段:
    1. 变性-加热双链模板DNA,将其分离成两股单链。
    2. 退火-当温度降低,使DNA引物与模板DNA结合时。
    3. 扩展- 当温度升高并通过Taq聚合酶制备新的DNA链。
  • 这三个阶段重复20-40次,每次都会加倍DNA拷贝数。
  • 一个完整的PCR反应可以在几个小时内完成,甚至在某些高速机器上不到一个小时。
  • PCR完成后,一种叫做电泳的方法可以用来检测产生的DNA片段的数量和大小。
展示聚合酶链式反应(PCR)的主要步骤的插图。

展示聚合酶链式反应(PCR)的主要步骤的插图。图片来源:基因组研究有限公司

在PCR的每个阶段会发生什么?

变性阶段

  • 在此期间,将含有模板DNA和所有其他核心成分的鸡尾酒加热至94-95˚C。
  • 温度过高会导致氢键在两股模板DNA的碱基之间断裂和两股分离。
  • 这就产生了两个单链DNA,它们将作为产生新DNA链的模板。
  • 重要的是,在这个阶段保持足够长的温度,以确保DNA链完全分离。
  • 这通常需要15-30秒。

退火阶段

  • 在这一阶段,反应被冷却到50-65⁰C。这使得引物通过氢键的方式附着在单链模板DNA上的特定位置(确切的温度取决于你使用的引物的熔化温度)。
  • 引物是单链DNA或者核糖核酸长度约为20到30个碱基的序列。
  • 引物被设计成互补依次依次在待复制的序列的每一端上的DNA的短部分。
  • 引物是DNA合成的起始点。聚合酶只能在双链DNA上添加DNA碱基。只有当引物结合后,聚合酶才能附着在松散的DNA碱基上,并开始形成新的DNA互补链。
  • 这两条分开的DNA链是互补的,方向相反(从一端- 5 '端-到另一端- 3 '端);因此,有两个引物-一个正向引物和一个反向引物。
  • 这一步通常需要大约10-30秒。

扩展阶段

  • 在该最终步骤中,加热增加到72μC,以使新DNA能够通过添加DNA碱基的特殊Taq DNA聚合酶进行。
  • Taq DNA聚合酶是一种取自嗜热性的酶细菌水生栖热菌
    • 这种细菌通常生活在温泉中,可以忍受80⁰C以上的温度。
    • 细菌的DNA聚合酶在高温下非常稳定,这意味着它可以承受在PCR的变性阶段分开分开DNA的股线所需的温度。
    • 大多数其他生物的DNA聚合酶都无法承受这样的高温,例如,人类的聚合酶在37℃(体温)下工作是理想的。
  • 72˚C是Taq聚合酶的最佳温度,以构建互补股。它附着在底漆上,然后在5'至3'方向上逐一将DNA碱基添加到单链。
  • 结果是全新的DNA和双链DNA分子。
  • 这一步的持续时间取决于被扩增DNA序列的长度,但通常需要1分钟左右复制1000个DNA碱基(1Kb)。

  • 这三个热循环过程重复20-40次,以产生大量感兴趣的DNA序列副本。
  • 在PCR期间进行的DNA的新片段也用作模板,DNA聚合酶可以附着和开始制备DNA。
  • 其结果是在相对较短的时间内产生大量特定DNA片段的拷贝。
展示聚合酶链反应(PCR)如何产生大量DNA副本的插图。

展示聚合酶链反应(PCR)如何产生大量DNA副本的插图。图片来源:基因组研究有限公司

最后更新于2016-01-25